Cell：周琪/李伟团队改造R2逆转座子，实现全RNA介导的精准大片段基因写入

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来源：生物世界

2024-07-09

研究结合基因组数据挖掘和大分子工程改造等手段，开发了使用RNA供体进行大片段基因精准写入的R2逆转座子工具，能够在多种哺乳动物细胞系、原代细胞中实现大片段基因（>1.5 kb）高效精准的整合，最高效率超过60%，成功实现了全RNA介导的功能基因（DNA）在多种哺乳动物基因组的精准写入，为新一代创新基因疗法的发展提供了基础。

基因组DNA是生命的蓝图，对基因组DNA实现任意尺度的精准操作代表对生命蓝图进行修改绘制的底层能力，是基因工程技术发展的核心。以CRISPR基因编辑技术为代表的技术进步已经基本实现了单碱基和短序列尺度的精准编辑。然而，如何针对应用场景的需求，实现大片段基因尺度的DNA在基因组的高效精准整合，仍然是整个基因工程领域亟需突破的难题。如果该技术得到突破，意味着可以通过外源功能基因的精准写入来干预涵盖不同位点多种突变谱的基因所导致的遗传缺陷等疾病，从而开发更为通用的基因与细胞疗法，具有广泛的应用前景。

针对这一重大技术挑战，多种基因写入（gene writing）技术已被开发，但是这些技术大多依赖于DNA模板作为基因写入的供体（donor）。在实际医学应用中，DNA供体面临免疫原性高、在体递送困难、在基因组中具有随机整合风险等诸多挑战。相比之下，RNA供体具有更低的免疫原性、可被非病毒载体有效递送、在细胞内迅速降解，无随机整合风险等特点，能有效应对DNA供体所面临的挑战。因此，以RNA为供体的大片段精准写入技术，在安全性、可递送性方面都具有显著优势。然而，现有以RNA为供体的技术，要么无法实现>200 bp的DNA片段高效整合（例如先导编辑等），要么依靠基因组随机整合从而带来基因组随机突变风险（例如逆转录病毒等）。

是否能够以RNA作为供体，实现功能基因尺度的大片段 DNA 基因组精准定点整合？仍然是基因工程领域面临的挑战。

R2逆转座子是真核生物中广泛存在的一种以RNA作为媒介的逆转座子，它专一性地“定居”在宿主28S rDNA基因组位点上，借助宿主基因的启动子，合成自身的RNA和蛋白质并组装形成R2复合物。R2复合物可再次识别宿主28S rDNA上的专一性位点,通过逆转录合成cDNA，将R2基因序列重新整合到宿主基因组上，完成“增殖”。这一机制与以RNA作为供体的基因写入工具的开发思路不谋而合，同时，28S rDNA位点在人基因组中拷贝数目多（约219个），且远离蛋白编码基因，是适合于外源基因整合的安全港位点。

因此，R2逆转座子是以RNA为供体的大片段基因精准写入工具开发的有力的候选者。然而，尽管R2逆转座子早在上世纪80年代就被发现，其在哺乳动物细胞中的功能性质尚未被系统性地探索，迄今为止，未能被利用来在哺乳动物细胞中实现大片段功能基因的有效整合。

2024年7月8日，北京干细胞与再生医学研究院/中国科学院动物研究所李伟研究员与周琪院士团队合作，在国际顶尖学术期刊 Cell 上发表了题为：All-RNA-mediated Targeted Gene Integration in Mammalian Cells with Rationally Engineered R2 Retrotransposons 的研究论文。

该研究结合基因组数据挖掘和大分子工程改造等手段，开发了使用RNA供体进行大片段基因精准写入的R2逆转座子工具，能够在多种哺乳动物细胞系、原代细胞中实现大片段基因（>1.5 kb）高效精准的整合，最高效率超过60%，成功实现了全RNA介导的功能基因（DNA）在多种哺乳动物基因组的精准写入，为新一代创新基因疗法的发展提供了基础。

All-RNA-mediated Targeted Gene Integration in Mammalian Cells with Rationally Engineered R2 Retrotransposons 的研究论文

在这项研究中，研究团队首先通过数据挖掘，全面系统地分析了自然界中R2逆转座子元件的生物多样性；通过构建基于RNA供体的基因写入的报告体系，成功筛选出在哺乳动物细胞中具有完整GFP基因整合活性的R2Tg系统（来源于一种鸟Taeniopygia guttat的基因组）。

为了探究影响R2整合活性的因素，研究团队从R2Tg系统的供体RNA与R2Tg蛋白两方面做了系统性探究与工程化改造。对于R2Tg供体RNA中的UTR元件，研究团队首先通过SHAPE-MaP实验以及多序列比对，绘制了UTR的二级结构。结合序列删减或位点突变，发现5'UT中含有HDV样核酶，并且在R2的整合过程发挥重要的功能。同时，研究团队发现删除3'UTR中的一段茎环结构可以显著提升R2在哺乳动物细胞中的逆转座效率。对于R2Tg蛋白，研究团队使用AlphaFold2预测了R2T蛋白的三维结构，结合R2蛋白质进化信息，在R2蛋白中引入氨基酸点突变，或者偶联与核酸结合或加工相关的小蛋白结构域，均成功提高了R2系统的活性。结合上述工程化的供体RNA与蛋白进行进一步优化，研究团队最终获得了在人细胞系中超过20%基因整合效率的en-R2Tg工具。

系统的工程化改造获得en-R2Tg工具

由于R2蛋白质可以通过mRNA表达，且供体RNA本身也是RNA，那么，en-R2Tg工具能否以全RNA形式介导的基因的高效精准写入？

为了探究这一点，研究团队通过体外合成获得了编码R2蛋白质mRNA以及供体RNA，并使用脂质体递送的方式将两条mRNA导入人的细胞中。结果显示，en-R2Tg工具能够高效整合多个与疾病治疗相关基因，且这些基因能够有效表达功能蛋白。能够以全RNA的形式发挥功能，意味着en-R2Tg工具可以使用安全性已经在临床上得到证明的纸质纳米颗粒（LNP）进行递送，这将有可能解决长久以来基因写入工具依赖病毒载体进行高效递送的难题。

研究团队发现，使用LNP递送en-R2Tg工具在人的肝脏细胞系中能够实现25%的基因整合效率。此外，研究团队还证明R2工具在人类原代细胞中同样具有活性；同时，通过显微注射将en-R2Tg工具导入小鼠胚胎，成功实现了超过60%的GFP基因定点整合效率。

该研究的另一关键点在于，工程化改造的en-R2Tg工具是否还保留有天然R2逆转座子的28S rDNA位点特异性整合这一性质？

为了回答这一问题，研究团队结合无偏好的基因整合富集高通量测序以及全基因组三代测序方法，发现en-R2Tg工具在全基因组范围内展现了极高的基因整合特异性，大于99%的外源基因都精准整合到28S rDNA安全港位点。同时，结合qRT-PCR以及RNA-Seq实验，研究团队发现en-R2Tg工具对细胞的转录组状态几乎没有影响。这说明en-R2Tg介导的基因写入是位点精准特异的，可以有效避免逆转录病毒等技术所产生的基因随机整合导致的基因突变风险。

全RNA介导的、高效精准的哺乳动物细胞大片段功能基因写入工具

综上，该研究基于自然界存在的R2逆转座系统，结合数据分析和工程化改造方法，成功开发了全RNA介导的、高效精准的基因写入技术，首次在多种人和小鼠细胞系及原代细胞中实现了功能基因的定点整合。R2基因精准写入工具在递送和安全性方面具有显著优势，未来有望基于此工具开发在体功能基因回补写入以及在体生成CAR-T细胞等全新的疾病治疗方法。值得注意的是，R2基因写入技术目前无法实现在不同基因组位点的可编程写入，且在人原代细胞中的基因写入效率较低，因此未来需要进一步发展和优化。

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