引言：双特异性抗体（bispecific antibodies, bsAbs）是一类能够同时靶向两个不同抗原表位的治疗性抗体。相较于传统单克隆抗体（mAb），bsAbs在肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾病和感染性疾病中展现出更高的特异性和更低的副作用风险。截至2025年，全球已有14款bsAb药物获批上市，另有数百种处于临床前研究阶段。然而，bsAb的复杂结构（图1）使其下游纯化面临巨大挑战：
本文将系统解析bsAb纯化的核心策略，涵盖捕获层析、杂质去除技术及未来发展方向，为生物制药工艺开发提供全面指导。
图1 | 双特异性抗体的结构分类：对称型与非对称型、IgG样与非IgG样结构。
一、捕获层析：从Protein A到新型技术
1.1 传统亲和层析：Protein A的黄金标准
Protein A亲和层析是bsAb捕获的核心技术，其通过结合抗体的Fc区域实现高特异性捕获。近年来，高载量树脂（如MabSelect PrismA）的研发显著提升了效率：
局限性：
1.2 非Fc依赖型捕获技术
对于缺乏Fc区域的非IgG样bsAb，需采用轻链（LC）靶向亲和层析：
1.3 混合模式层析：新一代捕获方案
混合模式层析结合离子交换、疏水作用等多机制，展现出独特优势：
创新应用：
图2 | 典型下游纯化流程：捕获、低pH病毒灭活、精纯、病毒过滤等步骤。
二、产物相关杂质去除策略
2.1 同源二聚体：结构错配的克星
2.1.1 亲和层析差异化捕获
2.1.2 离子交换层析电荷调控
2.1.3 混合模式层析多维分离
图3 | 不同亲和层析配体的结合位点：Protein A（Fc）、MabSelect PrismA（Fc+VH3）、KappaSelect（κ轻链）等。
2.2 片段杂质：从半抗体到单臂片段
2.2.1 亲和层析精准去除
2.2.2 混合模式层析高效精纯
2.3 聚集体：免疫原性的隐形杀手
2.3.1 亲和层析洗脱优化
2.3.2 混合模式层析多维清除
图4 | 产物相关杂质类型：同源二聚体、半抗体、聚集体等。
三、工艺相关杂质清除技术
3.1 宿主细胞蛋白（HCP）
3.1.1 层析与深度过滤联用
3.1.2 上游工艺联动
3.2 病毒安全：从灭活到过滤
3.2.1 低pH灭活
3.2.2 层析与膜过滤
3.3 内毒素：电荷差异的利用
四、工艺整合与未来展望
4.1 经典流程 vs 创新模式
图7 | （A）经典流程；（B）混合模式替代离子交换；（C）混合模式替代Protein A。
4.2 技术前沿：数字化与连续生产
五、结语
双特异性抗体的下游纯化是一场特异性与效率的博弈。从Protein A的黄金标准到混合模式层析的创新突破，从同源二聚体的精准分离到病毒安全的全面保障，每一步技术进步都在推动bsAb药物的临床转化。未来，随着AI与连续生产技术的深度融合，抗体纯化将迈向更高纯度、更低成本的智能化时代。
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