用于生物生产的哺乳动物细胞生长动力学工程

       在生物制药的 "江湖" 里，想要精准拿捏哺乳动物细胞的生长节奏，那可真是堪比 "驯服一匹烈马"-- 难上加难！不过别慌，我们这次带来了一套超牛的 "细胞改造秘籍"，要用多层次细胞工程策略，把哺乳动物细胞的生长阶段安排得明明白白！

       咱们先给细胞来一场 "死亡抵抗特训"。利用 CRISPR/Cas9 这把 "基因剪刀"，果断敲除促凋亡蛋白 Bax 和 Bak。这就好比给细胞穿上了 "死亡免疫铠甲"，大大降低了细胞凋亡的概率，不仅提高了细胞活力，还成功给细胞的 "寿命" 续费，让它们能在培养过程中 "超长待机"。

       光有 "抗衰 buff" 可不够，接下来得给细胞装个 "加速引擎"。我们整出了一套类似 "油门" 的生长加速系统，基于脱落酸诱导系统，精准调控 cMYC 基因表达。只要轻轻一踩 "油门"，细胞就像开了挂一样，疯狂增殖，细胞密度 "蹭蹭" 往上涨，细胞周期也被我们稳稳掌控。

       有了 "油门"，自然也得配上 "刹车"。于是，我们又打造了一个基于 BLIMP1 基因的四环素诱导基因回路，就像汽车的 "刹车踏板"。一旦激活，细胞立马 "踩刹车"，停止生长，细胞周期也被牢牢阻滞在特定阶段。

       最后，终极 "王炸" 来了！我们把 "油门" 和 "刹车" 合二为一，开发出双重可控系统。这下，哺乳动物细胞的生长动力学就像被我们握在手中的提线木偶，想快就快，想停就停，实现了动态又精准的调控！

       这项研究堪称合成生物学工具和组合细胞工程应用的 "神仙打架" 现场，不仅为操纵哺乳动物细胞生长搭建了一个超复杂的框架，还为生物制药生产和生物医学应用提供了一个超独特的范例，简直就是科研界的 "六边形战士"！

       亮点

•        生物生产界的 "精密仪器"：设计哺乳动物细胞生长动力学，让生物生产精度直接 "拉满"，误差？不存在的！
•        基因控制界的 "老司机组合"：利用正交诱导电路，打造生长控制的 "油门和刹车" 系统，细胞生长节奏由我们说了算！
•        细胞平台界的 "全能选手"：定制生长阶段，产出多功能哺乳动物平台，生产效率高、结果超可预测，生物制药的未来就靠它了！

       简介

       在复杂生物药物生产的 "C 位"，永远站着哺乳动物细胞这位 "大佬"，不管是重组单克隆抗体，还是基于病毒载体的产品，都离不开它的 "辛勤劳作"。在典型的生物制药批次生产中，哺乳动物细胞的生长就像一场 "闯关游戏"，要经历生长、稳定和衰退死亡这些关卡，每一关都决定着细胞是 "努力干活生产产品"，还是 "躺平摆烂"。

       控制细胞生长的机制，那叫一个 "盘根错节"，外在的营养物质、生长因子，内在的细胞周期调节剂、应激反应，各种因素 "你方唱罢我登场"，交织成一张复杂的大网。尽管现有的生物工艺策略已经能在一定程度上调节培养阶段，但想要精准控制细胞生长动力学，还是像在迷雾中找路 -- 难啊！

       不过，要是能给细胞装上一套 "油门和刹车" 系统，实现对生长和稳定期的动态控制，那可就厉害了！就像给汽车发动机配上了 "黄金搭档"，操控性直接起飞！而要打造这套系统，关键就在于找到能调节细胞周期和代谢关键基因表达的 "神秘钥匙"。

       在我们之前的研究里，发现了 cMYC 和 BLIMP1 这两位 "宝藏选手"。它们就像细胞世界里的 "油门" 和 "刹车"，在 B 细胞和浆细胞的发育过程中，上演着一场精彩绝伦的 "爱恨情仇"。cMYC 在早期 B 细胞中 "风头无两"，掌控着细胞增殖、存活和代谢；而 BLIMP1 一登场，就像给 cMYC 按下了 "暂停键"，抑制它及其下游靶标，助力细胞向抗体分泌状态 "华丽变身"。

       cMYC 要是 "放飞自我" 异位表达，细胞就会疯狂增殖，细胞周期也变得 "整整齐齐"，活脱脱一副癌细胞的 "嚣张模样"。相反，BLIMP1 要是 "过度发力" 过表达，细胞就会被 "强制下线"，生长停止，细胞周期停滞在 G1/G0 期。

       但改造细胞生长动力学可不是一帆风顺的，还得小心 "凋亡陷阱"。cMYC 的 "超速增殖" 和 BLIMP1 的 "持续刹车"，都可能触发细胞凋亡的 "警报"。cMYC 高表达会通过上调促凋亡蛋白或者引发 DNA 损伤反应，把细胞往凋亡的 "悬崖" 上推；BLIMP1 也不甘示弱，通过内质网应激和激活未折叠蛋白反应，诱导细胞走向凋亡。所以，用 cMYC 和 BLIMP1 当 "油门" 和 "刹车"，得像走钢丝一样小心翼翼，还得顺便改造一下细胞的死亡阶段，把潜在的凋亡风险 "扼杀在摇篮里"。

       在本研究中，我们决定 "挑战极限"，对细胞的对数增长、稳定期和死亡这三个关键阶段 "下手"。为此，精心设计了一套多层次细胞工程策略，用上 CRISPR/Cas9 基因组工程和正交可诱导基因回路，实现对 cMYC 和 BLIMP1 表达的 "花式调控"。

       一开始，我们先敲除 Bax 和 Bak，打造出抗死亡的哺乳动物细胞平台。接着，给细胞系 "升级装备"，让它能表达 r - 单克隆抗体，再把控制 cMYC 和 BLIMP1 基因表达的回路 "安装" 到基因组里。最后，开发出双重可控系统，实现对细胞生长阶段的精准控制，充分展示了基因重新设计在生物工艺中的巨大潜力！想知道具体的实验操作和结果？快到原文里一探究竟吧！

       图 1.利用 CRISPR/Cas9 介导的敲除 (KO) 技术构建抗死亡哺乳动物细胞。A ) 培养过程中哺乳动物细胞生长阶段示意图。B) 本研究中应用的细胞工程和细胞系开发工作流程。C) Bax (NW_003614570.1) 和 Bak (NW_003614972.1) 基因中外显子（白色）和内含子（黑色）示意图。靶向 Bax 和 Bak 外显子 1-3 的gRNA 序列如表 S1所示。D) 对照 CHOK1 (HD)、Bax SKOs (X 1-5 )、Bak SKOs (K 1-6 ) 和 Bax-Bak DKOs (XK 1-8 ) 中Bax、Bak和 ERK蛋白表达的蛋白质印迹分析。红色方形框表示使用批次培养进一步表征的克隆。此外，图S3描述了Bax、Bax SKO和DKO细胞系所有克隆的批次培养特性。E)和F) Bax SKO、Bak SKO和Bax-Bak DKO细胞系的活细胞密度和细胞活力概况。(黑色)对照CHOK1宿主，(蓝色)Bax SKO (CHOX 5 )，(绿色)Bak SKO (CHOK 4 )和(白色)Bax-Bak DKO (CHOXK 6 )。实验值代表三次生物学重复(n = 3)的平均值±SEM。

       结果

       哺乳动物细胞死亡阶段的调控

       调控哺乳动物细胞的生长阶段，就像在玩一场超复杂的 "基因拼图游戏"，每个阶段都得精准 "拿捏"（图 1A）。为了完成这场 "游戏"，我们制定了一套连续细胞工程方案，分三步 "通关"：减弱细胞死亡、加速对数生长期、激活稳定期（图 1B）。

       第一关，先解决细胞死亡的 "大麻烦"。我们派出 CRISPR/Cas9 这员 "大将"，针对促凋亡蛋白 Bax 和 Bak 发起 "进攻"，目标是打造抗死亡的哺乳动物细胞系。就像设计 "寻宝路线" 一样，我们根据 Bax 和 Bak 的编码序列，设计了三个引导 RNA（gRNA），专门 "瞄准" 转录本外显子缺失。

       第一轮 "战斗"，我们分别对 Bax 和 Bak 进行单敲除（SKO），然后用有限稀释克隆法，像 "大海捞针" 一样筛选出单细胞克隆。最后成功分离出 5 个 Bax SKO 单细胞克隆（CHOX 1 至 CHOX 5）和 6 个 Bak SKO 单细胞克隆（CHOK 1 -CHOK 6）。

       为了确认 "战斗成果"，我们用 TIDE PCR 在基因组水平上查看是否有插入或缺失，再用 Western blot 在蛋白质水平上 "验明正身"。确认无误后，我们选了 Bak SKO 克隆 CHOK 1 和 CHOK 6，发起第二轮 "进攻"，生成 Bax/Bak 双 KO (DKO) 细胞克隆。又经过一番 "精挑细选"，从亲本宿主中分离出 8 个 Bax/Bak DKO 细胞克隆（CHOXK 1-4 和 CHOXK 5-8），并且所有克隆都在基因组和蛋白质组水平上成功实现 Bax 和 Bak 敲除。

       对这些克隆进行初步 "体检"，发现它们在减缓细胞活力下降方面效果显著（图S3）。我们从中挑出 CHOX 5、CHOK 4 和 CHOXK 6 细胞系，和亲本 CHOK1 一起进行标准批次培养，看看它们的生长和细胞活力有啥不同。结果发现，SKO 和 DKO 细胞系的生长曲线 "神同步"，生长率和细胞密度峰值都差不多，而且细胞活力比对照 "蹭蹭" 往上涨（图 1D 和 E）。特别是 Bax 和 Bak DKO，在提高细胞活力上还有 "1+1>2" 的协同效果！这波操作，直接让细胞死亡大幅减轻！

       细胞抗死亡能力有了，接下来得看看它们的 "生产能力"。我们给 Bax 和 BakDKO 细胞系以及对照 CHOK1 细胞系 "加载" r-IgG1 抗体生产程序，用含有人源 IgG1 抗体序列的表达载体转染细胞，再经过嘌呤霉素抗性筛选，找到单细胞克隆（CHOXKIgG1 和 CHOK1 IgG1）。

       在 14 天的标准批次培养中，我们全程 "紧盯" 这些细胞的生长、活力、IgG1产生和凋亡状态（图 2）。结果令人惊喜！和对照 CHOK1 IgG1 细胞系相比，Bax 和 Bak DKO 细胞系就像开了 "生产外挂"，培养寿命延长，活力满满（图 2A 和 B），IgG1 产量和细胞特异性产量也更高（图 2C 和 D），而且并不是因为 IgG1 产生细胞系生长过程有变化，而是培养寿命延长带来的 "福利"。

       我们还仔细检查了凋亡信号通路，发现 Bax 和 Bak 蛋白 "消失得无影无踪"，它们的下游效应分子（裂解的 caspase 3 和 7 以及 caspase 9）在不同培养时间点的表达也大幅降低（图 2F）。这直接导致 CHOXK IgG1 在培养第7 天和第 8 天的细胞凋亡数量显著减少（图 2G）。看来，Bax 和 Bak DKO 是通过 "切断" 下游信号蛋白级联反应，成功减少了细胞凋亡！

       图 2.IgG1产生型抗死亡细胞系的开发。A )、B) 和 C) CHOXK IgG1 和对照 CHOK1 IgG1细胞系的活细胞密度、细胞活力和 IgG1 产生情况。D) 细胞特异性生产力。E) IgG1 重链 (HC) 和轻链(LC) mRNA 表达。F) 凋亡相关蛋白的蛋白质印迹分析：Bak、Bax、Caspase 3、7 和 9。G) 使用Annexin V/PI染色进行凋亡分析。(*)、(**)、(***) 和 (****) 分别表示 p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（t检验）。实验值代表三个生物学重复 (n = 3) 的平均值 ± SEM。

       加速细胞生长：一场需要 "刹车" 的竞速赛

       在哺乳动物细胞的 "成长赛道" 上，提升细胞生长速度这事儿，和细胞系开发、生物工艺放大可算是 "拜了把子"，关系铁得很！但要是放任细胞撒丫子疯长，就好比给没驾照的新手一辆超跑 -- 麻烦大了！不受控制的快速生长，会让细胞出现基因型、表型 "大变脸"，还可能触发凋亡事件，在培养过程中直接"摆烂"，交出糟糕的 "成绩单"。所以说，设计一套细胞生长加速系统，必须得给它配上 "高精度方向盘" 和 "强力刹车"，实现超稳操控！

       为了拿捏住细胞生长的 "命脉"，我们整出了一个超牛的基因组整合系统，它的核心 "操盘手" 是 cMYC 基因 -- 这位可是细胞增殖界的 "明星诱导剂"，名气响当当！接着，我们又构建了一个能被培养基里的脱落酸（ABA）"唤醒" 的诱导性遗传回路，咱给它取名叫 ABA-MYC。ABA-MYC 系统的 "工作原理" 就像一场精妙的分子 "双人舞"：当 ABA 出现，PYL1 和 ABI 结构域就开始 "贴贴"，跳起可逆二聚化的 "华尔兹"。这一 "贴" 可不得了，PYL1融合的 VP16 转录激活结构域，就会像被施了魔法一样，顺着 ABA 的 "指挥棒"，精准 "募集" 到和 PhIF 阻遏物（TET 阻遏物的 "亲兄弟"）相连的DNA 结合结构域上，而这个结构域又和 ABI "手拉手"（见图 3A）。为了防止ABA-MYC 系统突然 "抽风" 意外启动，我们还在 PhIF DNA 结合结构域和ABI 之间安了个 "核输出信号（NES）"，就像给它们之间加了一道 "安全门"；同时，给 VP16-PYL1 连上核定位信号，确保分子 "舞蹈" 按剧本走。这些分子元件 "通力合作"，让二聚化的 PhIF-NES-ABI 和 NLS-VP16-PYL1 顺利 "冲进" 细胞核，瞬间激活 cMYC 基因和报告基因 mCherry 蛋白的 "表演"。为啥选 ABA 诱导系统？因为它够 "低调"，背景激活值低，一旦被激活，又能 "高调" 输出，实现高水平表达，妥妥的 "宝藏选手"！

       为了验证这套系统是不是真的 "能打"，我们培养出了整合 ABA-MYC 回路的 CHOXKIgG1 细胞系的稳定克隆细胞系，这样就能通过在培养基里加 ABA，像调节音量旋钮一样，精准控制 cMYC 的 "表达音量"。实验结果超给力！通过 ABA-MYC 回路的诱导，我们在 mRNA 和蛋白质水平，都实现了对 cMYC 和 mCherry 基因表达的精准 "拿捏"，而且表达量和 ABA 浓度完美 "挂钩"（见图 3B、C 和 D）。cMYC 一被激活，细胞就像打了 "生长鸡血"，生长速度狂飙，IgG1 的产量也跟着 "搞事情"。我们发现，培养基里的 ABA 浓度越高，细胞密度就 "蹭蹭" 往上涨（见图 3E 和 F），细胞活力也跟着 "水涨船高"，这大概是因为 cMYC 对细胞有 "续命" 的神奇功效。不过，细胞增殖加快，细胞周期分布也 "变了天"：G1 期细胞数量 "缩水"，G2 期细胞数量 "暴涨"，只有 S 期 "稳如泰山"（见图 3G）。但在 IgG1 产量这边，剧情却来了个大反转 --cMYC 表达越高，产物滴度和细胞特异性产量反而越低（见图 3H 和 I）。这就好比细胞在 "生长" 和 "生产" 之间玩起了 "跷跷板"，一方增强，另一方就得 "让步"。我们检查了 IgG1 HC 和 LC mRNA 的表达，发现没啥明显变化，看来 IgG1 产量下降，就是 cMYC 表达 "搞的鬼"！这些数据实打实地证明，cMYC 作为细胞生长加速的 "靶点"，那是相当靠谱！和可诱导系统 "联手" 后，就能轻松调控哺乳动物细胞的生长能力。我们还在 CHOK1IgG1 和 HEK293 细胞系里测试了 ABA-MYC 回路，结果都和之前的实验 "对上了暗号"，活细胞密度增加，IgG1 产量减少，妥妥的 "实力认证"！

       图3.开发一种可编码cMYC基因表达的脱落酸(ABA)诱导型基因回路，用于调控IgG1产生型抗死亡细胞系(CHOXK IgG1 -ABA-MYC)的对数生长期。A ) 表达cMYC和mCherry基因的ABA-MYC回路示意图，该回路在PhlF可激活启动子的作用下进行，由最小CMV启动子上游的六个PhlF操纵子组成。ABA诱导空间分离的PYL1和ABI结构域二聚化，导致PhlF DNA结合结构域与VP16转录激活结构域结合，从而诱导基因表达。B) mCherry荧光表达。C)和D) cMYC分别在mRNA和蛋白质水平上的表达。E) 活细胞密度。F) 细胞活力曲线。G) 细胞周期分布。H) IgG1产量滴度。I) 细胞特异性生产力。 J) 和 K) 分别为 IgG1 HC 和 LC mRNA 的表达。(黑色) 未诱导对照，(粉色) 2.5 μM ABA，(红色) 5 μM ABA 和 (深红色) 10 μM ABA。(*)、(**)、(***) 和 (****) 分别表示p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（单因素方差分析）。实验值代表三个生物学重复 (n = 3) 的平均值 ± SEM。

       诱导稳定期：给细胞按下 "暂停键" 的魔法

       哺乳动物细胞的稳定期，就像细胞生长路上的 "服务区"，到了这儿，细胞生长直接 "踩刹车"。这一阶段的开启，可能是被各种内在、外在的 "刺激信号" 召唤来的。稳定期一到，细胞密度就 "躺平" 保持恒定，细胞周期蛋白也开始 "调整工作模式"。对哺乳动物细胞生物工艺来说，稳定期可是个 "香饽饽"，能大幅提升生产力。但尴尬的是，它常常是因为碰上营养 "断粮"、压力 "爆表" 等糟糕环境才出现。所以，我们决定开发一套 "魔法系统"，能按需诱导稳定期，还不折腾培养环境！

       为了精准控制细胞生长 "踩刹车"，我们围绕 BLIMP1 基因设计了一套基因回路。BLIMP1 基因那可是细胞周期和细胞分化领域的 "大佬"，妥妥的 "主调节器"！我们借助 Tet-On rtTA/tTS 系统，搭建起 TET-BLIMP1 回路。这个回路就像一个 "双重保险" 调控框架：没有四环素（TET）时，tTS 蛋白就像个 "严厉的监工"，死死抑制目的基因（GOI）的表达；一旦 TET 出现，rtTA蛋白立刻 "变身"，成为激活基因表达的 "超级助推器"。tTS 蛋白是 TetR（Tet 阻遏蛋白）和 KRAB-AB（Kid1 蛋白的转录阻遏结构域）"合体" 而成，专门和 TRE 启动子 "绑定"，掐断基因转录的 "电源"；rtTA 蛋白则是rTetR（TetR 突变体）和 VP16 的 "融合战士"，在 TET 的 "召唤" 下，激活 TRE 启动子，让 BLIMP1 基因和报告蛋白 GFP "闪亮登场"（见图 4A）。这套双重调控系统超 "靠谱"，几乎不会出现 "表达泄漏"，对 TET 的响应也超灵敏！

       图4.构建四环素 (TET) 诱导的编码 BLIMP1 基因表达的基因回路，用于调控产生 IgG1 的抗死亡细胞系 (CHOXK IgG1 -TET-BLIMP1) 的稳定期。A ) TET-BLIMP1 回路示意图，该回路在四环素 TREt 启动子下表达 cMYc 和 GFP 基因。TET 与 rtTA 结合后，诱导 TREt 启动子基因表达，该启动子由最小 CMV 启动子上游的六个 TetO 序列组成。B) GFP 荧光表达。C) 和 D) BLIMP1 分别在 mRNA 和蛋白质水平上的表达。E) 活细胞密度。F) 细胞活力曲线。G) 细胞周期分布。H) IgG1 产量滴度。I) 细胞特异性生产力。J) 和 K) 分别表示 IgG1 HC 和LC 的 mRNA 表达。（黑色）未诱导对照，（浅绿色）250 ng/mL TET，（绿色）500 ng/mL TET 和（深绿色）1000 ng/mL TET。（*）、（**）、（***）和（****）分别表示 p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（单因素方差分析）。实验值代表三个生物学重复（n = 3）的平均值±SEM。

       我们把 TET 诱导回路整合进 CHOXKIgG1 细胞系，培育出稳定细胞系，这样就能用培养基里的 TET，像调节灯光亮度一样，精准调控 BLIMP1 的表达。实验时，往培养基里加 TET，TET-BLIMP1 回路立马 "开工"，对 BLIMP1 和 GFP基因的调控效果，在 mRNA 和蛋白质水平都清晰可见（见图 4B、C 和 D）。BLIMP1 一被激活，细胞生长和 IgG1 产量就开始 "大变样"，而且变化程度和 TET 浓度 "锁死"，完美对应。随着 TET 浓度升高，细胞密度就像泄了气的气球，逐渐下降（见图 4E）。和 ABA-MYC 回路激活类似，TET-BLIMP1 回路激活后，细胞活力也 "支棱" 起来了，这大概是因为细胞数量少了，对 "粮草" 的需求也跟着降低。BLIMP1 让细胞生长 "踩刹车"，细胞周期也跟着 "停车"：G1 期细胞数量 "暴增"，G2 期细胞数量 "暴跌"，S 期依旧 "淡定"（见图 4G）。在 CHOXK IgG1 细胞里，诱导 BLIMP1 简直像给细胞装上了 "生产力加速器"，IgG1 滴度飙升 2.1 倍，细胞特异性生产力更是猛增 10 倍（见图 4H 和 I）！和 ABA-MYC 回路激活的效果一对比，简直是 "冰火两重天"，这也实锤了哺乳动物细胞的生产能力和增殖能力之间的 "爱恨情仇"。我们分析了 HC 和 LC 的 r-IgG1 转录本的 mRNA 表达，发现没啥变化，看来 IgG1 产量增加，就是 BLIMP1 "搞的好事"！这些数据充分说明，BLIMP1 就是诱导生长停滞、提升细胞生产力的 "潜力股"！和可靠的诱导系统"组队" 后，就能让细胞生长稳稳 "减速"，顺利进入早期稳定期，把哺乳动物细胞的生产力拉到 "满格"！我们又在 CHOK1IgG1 细胞和 HEK293 细胞里测试了 TET-BLIMP1 回路，结果依旧 "稳如老狗"，活细胞密度下降，IgG1产量增加，完美 "复刻" 之前的实验结果！

       双重可控系统：细胞生长的 "智能遥控器"

       前面我们成功开发出了调控哺乳动物细胞生长阶段的 "秘密武器"，能减缓细胞死亡、加速生长期、诱导稳定期，ABA-MYC 和 TET-BLIMP1 回路也用实力证明，它们能各自 "独当一面"，精准控制细胞的生长期和稳定期。但生物工艺这事儿，可比想象中复杂多了，光有 "单打独斗" 可不行，还得能实现动态调控，才能让细胞发挥出最佳 "战斗力"！想要把这些工具的潜力全挖出来，用在哺乳动物细胞生物工艺上，就得像操控智能家电一样，能精细调节、协调细胞的生长期和稳定期！

       说干就干！我们开发出了一个 "双重可控平台"，把 ABA-MYC 和 TET-BLIMP1回路都 "打包" 整合到抗死亡 CHOXKIgG1 细胞系里（见图 5A）。整合完 ABA-MYC 回路的细胞，再 "喂" 上 TET-BLIMP1 回路，接着走细胞系开发流程，又是抗生素筛选，又是基于 FACS 的限制稀释克隆，最后进行单克隆选择，一顿操作猛如虎！为了检验 ABA-MYC 和 TET-BLIMP1 系统的 "双人配合" 能力，我们通过分析荧光 mCherry 和 GFP 报告基因的表达，测试它们对诱导物的 "敏感度"。结果超惊喜！整合了两种基因回路的细胞，对相应诱导物那叫一个 "专一"，往培养基里分别加 ABA 和 TET，mCherry 和 GFP 立马 "亮灯" 表达（见图 5B 和 C），妥妥的 "指哪打哪"！

       图 5.哺乳动物细胞生长期和稳定期的双重可控系统。A ) 控制 cMYC（决定生长期）和 BLIMP1（决定稳定期）表达的正交遗传回路示意图。B) 和 C) 分别在存在和不存在ABA 和 TET 诱导物的情况下的 mCherry 和 GFP 荧光。D) 活细胞密度曲线。E)细胞特异性生长率。F) 细胞活力曲线。G) IgG1 产生。H) 细胞特异性生产力。（黑色）对照条件：CHOXK IgG1 -ABA-MYC/TET-BLIMP1加 2% DMSO，（紫色）诱导条件 CHOXK IgG1 -ABA-MYC/TET-BLIMP1 加ABA 和 TET 分别用于生长期和稳定期。生长期（以cMYC激活定义）是通过在第2、4和6天用5 μM ABA诱导ABA-MYC回路实现的。稳定期（以BLIMP1激活定义）是通过在第7、10和12天用1 μM TET诱导TET-BLIMP1回路实现的。(*)、(**)、(***)和(****)分别表示p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（二向方差分析）。实验值代表三次生物学重复（n = 3）的平均值±SEM。

       为了测试这套双重可控系统在实际培养环境中的 "真本事"，我们制定了一套双相生物处理策略。第一阶段先激活 ABA-MYC 回路，给细胞生长 "踩油门"；等细胞 "跑" 起来了，再激活 TET-BLIMP1 回路，让细胞 "稳稳停车"。在生长加速阶段，激活 ABA-MYC 回路的细胞，就像装上了 "涡轮增压器"，细胞密度 "唰唰" 往上涨，细胞特异性生长率也把未诱导细胞远远甩在身后，最高能达到约 18 x 10^6 cells/mL，比未诱导细胞多出 80%（见图 5）！在 rIgG1产量方面，诱导细胞和未诱导细胞的生产曲线 "神同步"，诱导细胞的产量还略胜一筹，但细胞特异性生产力没啥差别。不过，和只表达 ABA-MYC 回路的细胞相比，我们这套双系统在生产力结果上却 "闹起了分歧"。仔细一琢磨，问题可能出在基于 FACS 的克隆选择过程：当时为了选出 mCherry 和 GFP 表达都 "爆表" 的细胞群体，两个系统同时激活，结果一不小心，可能选出了一个被 BLIMP1 "暗中加持"、能力超强的克隆。这也提醒我们，这两个调控系统之间的 "互动" 太复杂，得好好研究，优化选择过程，才能让调控更稳、更准！

       到了第二阶段，我们把加了 ABA 的 "旧培养基" 换成加了 TET 的 "新套餐"，还把诱导和未诱导细胞的初始浓度都调成约 8 x 10^6 cells/mL，保证公平 "竞技"。这时候激活 TET-BLIMP1 回路，细胞立马 "急刹车"，生长停滞，细胞特异性生长速率 "断崖式下跌"，稳稳进入稳定期（见图 5D 和 E）。BLIMP1 让细胞密度降低的同时，还顺手 "奶" 了一口细胞活力，和只整合 TET-BLIMP1 回路的细胞反应一模一样。在产物生产方面，TET 诱导的细胞直接 "开大"，IgG1 产量和细胞特异性生产力 "原地起飞"，产物滴度暴增 3.2 倍，qP 提升 2.1 倍！

       总的来说，我们成功让抗死亡细胞系同时 "搭载" ABA-MYC 和 TET-BLIMP1 通路，而且完全没有 "表达泄漏"！用独立的小分子诱导剂，就能像操控遥控器一样，精准调控细胞的生长期和稳定期。这些成果充分说明，用多层次基因工程方法，在培养过程中调控哺乳动物细胞生长阶段，这事儿绝 对 "有戏"！

       讨论

       在细胞研究的江湖里，各路高手都在琢磨怎么拿捏哺乳动物细胞的 "成长密码"，而我们这次带来了堪称 "王炸" 的全面细胞工程策略！这就好比给细胞量身定制了一套超牛的成长指南，精准把控它们的生长节奏，直接优化生物工艺性能，让细胞们 "打工" 更卖力。

       以前也有不少研究，就像给细胞打了 "兴奋剂"，通过组成性过表达控制生长或抑制细胞凋亡的靶点，成功让细胞在不同生长阶段 "听话"。但咱这次玩的是 "高端局"，别人都是单打独斗，我们直接对哺乳动物细胞系进行多重工程改造，就像给细胞装上了三头六臂，能同时对三个培养阶段进行 "显微镜级" 的精细控制！

       在这项研究里，我们展示了组合细胞工程方法的 "神仙操作"。一方面，用 CRISPR/Cas9 这把 "基因剪刀"，咔嚓一下敲除促凋亡蛋白，直接掐灭细胞死亡的 "小火苗"；另一方面，在小分子诱导系统的 "指挥" 下，精准控制外源cMYC 和 BLIMP1 基因的表达，让细胞生长变得像踩油门刹车一样随心所欲。这两招一结合，就像是给细胞装上了智能导航，能精准调控细胞状态。想象一下，哺乳动物细胞就像一个个小小的 "生产车间"，我们这套方法就是给车间升级了设备，能大大提高具有商业价值的重组产品生产时间和规模的精准度，让这些 "车间" 产出翻倍！

       说到这里，得好好唠唠我们的 "独门秘籍"-- 把细胞调控系统比作汽车发动机。细胞生长的调控就像给发动机装上了 "油门和刹车踏板"，想加速就踩油门，想减速就踩刹车，精准度、灵活性和可操作性直接拉满！而减少细胞死亡，就好比给细胞系系上了安全带，装上了安全气囊，让培养的哺乳动物细胞在 "成长道路" 上稳如泰山，再也不怕 "翻车"。

       细胞凋亡可是哺乳动物细胞培养中的 "头号杀手"，专门搞破坏。不过别慌，当cMYC 和 / 或 BLIMP1 表达被诱导时，减弱细胞凋亡就成了超厉害的 "安全卫士"，能把凋亡信号的 "攻击" 挡在门外。我们的数据也超给力，双 Bak 和 Bax KO 就像两个勇猛的 "基因战士"，通过下调下游凋亡信号通路（Caspase3、7 和 9），有效减轻细胞死亡，直接延长了细胞的 "寿命" 和活力，就像给细胞打了 "续命针"。而且就算对这些 "抗死亡细胞系" 再进行基因操作，它们依然能 "坚守岗位"，抗死亡表型韧性十足，堪称细胞界的 "小强"！这和之前的研究结果也对上了，之前就有研究发现，同时敲除 Bak 和 Bax 或过表达抗凋亡蛋白，也能让细胞活力大增，看来我们这次是找对 "路子" 了！

       再来说说我们开发的 "油门和刹车踏板" 系统，这可是 "师出有名"，借鉴了B 细胞和浆细胞固有的调节机制。经过实战检验，它调节哺乳动物细胞生长率的能力那是杠杠的！cMYC 驱动的油门踏板就像个 "急性子"，灵活性和响应能力满分，在标准批次设置范围内，能让活细胞密度 "嗖" 地一下就冲到和补料分批培养相似的水平，简直是细胞生长的 "加速器"。这也让我们看到了设计基因组整合系统的巨大潜力，以后说不定能减少对昂贵的富集培养基 / 补料的依赖，给生物工艺 "降本增效"！

       而基于 BLIMP1 的刹车踏板也不甘示弱，它就像个 "稳压器"，能提前让细胞进入稳定期，而且不受特定培养基成分消耗的影响，想让细胞 "刹车" 就 "刹车"。这个稳定期诱导系统不仅能根据细胞特性定制生产力，还能把细胞生产生物制药的潜力全都 "榨" 出来。要是这两个系统联手，那就是 "王炸组合"，能全方位控制培养中哺乳动物细胞的行为和表型。我们开发的双控细胞系，就像给细胞安排了一场 "速度与激情" 的旅程，先踩油门让细胞快速生长，再踩刹车进入减速阶段，在整个培养过程中充满了变数和惊喜，还能精准控制哺乳动物细胞的关键性能参数。虽然我们只展示了一种潜在模式，但在补料分批培养和连续培养模型里，还有超多 "隐藏玩法" 等着我们去解锁！

       把目光放长远，这套系统的应用前景那可是一片光明！我们完全可以定制类似的系统，让它去 "征服" 各种各样的生物功能，解决不同的生物工艺挑战。想象一下，开发出能在特定培养阶段减轻氧化或内质网 (ER) 应激的系统，就像给细胞请了 "私人保镖"，专门应对各种 "危险"，这简直就是多因素生物工艺障碍的 "万能钥匙"！我们还打算为 r 生物药物建立精确的可诱导基因表达系统，让它能 "察言观色"，根据特定的培养阶段做出反应。这样就能在细胞生产力最大化的培养阶段，专门激活 r 基因的表达，给细胞系开发过程 "减负"，再也不用让基因一直 "加班" 了。不管是单独使用这些 "黑科技"，还是让它们组团 "出战"，都是为了让细胞在复杂的生物工艺环境中，变得更 "抗造"、更能 "打"！

       不过话说回来，我们提出的这种创新方法，虽然给扩大哺乳动物细胞平台规模带来了新希望，那些 ABA 或 TET 等小分子诱导的遗传回路也很强大、灵活，但它们想 "进军" 工业界，还得好好 "考核" 一番。诱导系统确实是调整细胞性能的 "得力助手"，能从细胞内部实现工艺强化，甚至赋予细胞新功能，让工艺过程更靠谱。但它也有 "小毛病"，对小分子诱导剂的依赖可能会增加生物药物的生产成本，而且在下游工艺中去除这些分子也是个 "老大难" 问题。

       别担心，我们早就想好 "对策" 了！我们建议应用基于内源性调节机制的 "油门和刹车踏板" 控制。未来可以探索使用特定启动子，这些启动子就像细胞里的"智能开关"，能在特定生长阶段或响应特定环境信号（比如细胞内代谢物或温度）时自动激活，替代小分子诱导剂。最近的研究也给我们 "打了气"，利用低温条件引导细胞系向特定表型进化，说不定能成为新的突破口。这些策略要是成功了，就能设计出超智能的遗传回路，让细胞自己根据培养环境变化做出反应，彻底摆脱对小分子的依赖，为细胞系开发和工艺优化打开新世界的大门！

       当然，想要这套系统在生物生产领域 "大展拳脚"，还有不少 "关卡" 要闯。为了展示 "油门和刹车踏板" 方法的原理，我们在简单的批次培养条件下做了研究，这样能更清楚地评估工程基因回路对细胞生长和生产力的影响，不受补料分批条件下培养环境变化的干扰。但我们也知道，生物制药生产的 "行业顶流"是强化补料、优化补料方案，还有连续灌流培养系统。所以研究这套方案在补料分批和灌流系统中的适用性，就是我们接下来的 "重头戏"。特别是灌流系统，工程细胞平台的长期稳定性是关键，工业应用需要对生产和表型稳定性进行 "魔鬼测试"，通常得让细胞传代培养超过 100 天，还要仔细评估培养性能参数。只有通过了这项测试，才能保证在工业细胞系开发过程中，产量稳定又可靠！

       为了让这套系统更 "完美"，我们还瞄准了两个关键领域。第一个领域是优化细胞生长和生产之间的平衡，就像在走钢丝，要找到那个 "完美支点"，提高整体产品产量。我们打算用实验设计 (DoE) 方法，就像给细胞做 "排列组合游戏"，系统地探索不同的诱导剂浓度和诱导时间，精准微调细胞生长和生产率之间的平衡，实现高细胞密度和高生产率的 "双赢"！第二个领域是提高重组蛋白的产量，我们要在细胞生产率最大化的培养阶段，专门定制转基因表达，给细胞 "开小灶"，减轻组成型表达的代谢负担，让复杂分子的产量 "蹭蹭" 往上涨。这些研究要是顺利，就能助力我们的新型细胞平台从 "实验室明星" 成功转型为 "工业生产主力"！

       虽然这套系统在 r - 单克隆抗体上已经 "大显身手"，但它和其他 IgG 型分子（比如 Fc 融合蛋白或多特异性抗体）能不能 "友好相处"，还是个未知数。而且它能不能攻克低滴度高度复杂蛋白质生产的难关，也值得我们在未来好好探索一番。不过总的来说，这项研究让我们看到了合成生物学工具和组合工程方法的无限潜力，说不定未来真能开发出高度可控的哺乳动物细胞工厂，让细胞们成为生物生产领域的 "超级工人"！

       原文：M. Torres, D. Mcconnaughie, S. Akhtar, et al., Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metabolic Engineering, 2024.