蛋白质降解在细胞生物学中扮演着至关重要的角色，它不仅参与细胞内蛋白质稳态的维持，还与多种疾病的发生发展密切相关。近年来，分子胶降解剂（Molecular Glue Degradators, MGDs）作为一种新兴的蛋白质降解策略，引起了广泛关注。MGDs通过诱导目标蛋白与E3泛素连接酶之间的相互作用，促使目标蛋白的泛素化和降解，为治疗多种难以成药的疾病提供了新的思路。在这一领域，CRBN（Cereblon）作为E3泛素连接酶CRL4CRBN的底物受体，已被证明是MGDs的关键靶点。CRBN能够通过特定的G-loop结构识别并结合目标蛋白（该结构在人类蛋白质组中普遍存在），从而实现对目标蛋白的降解。然而，目前对于CRBN靶标空间的探索还远远不够，尤其是在G-loop结构之外，是否存在其他能够被CRBN识别的结构或机制，仍然是一个亟待解决的问题。
2025年7月3日，来自美国Monte Rosa Therapeutics公司的研究团队在Science期刊上公布了一篇名为"Mining the CRBN target space redefines rules for molecular glue-induced neosubstrate recognition"的文章，对这一问题进行了深入探究。
文章标题，来源：doi/10.1126/science.adt6736
该文章主要描述了关于分子胶降解剂（MGDs）的研究，特别是它们如何通过诱导目标蛋白与E3泛素连接酶CRL4CRBN之间的接近性，导致目标蛋白的泛素化和降解。研究人员通过计算匹配算法和实验验证，系统地探索了CRBN靶标空间，并重新定义了MGD诱导的新底物识别规则，为未来的小分子药物开发提供了新的靶点和机制。
CRBN靶标空间在G-loop内的扩展以及超越G-loop的拓展
分子胶降解剂（MGDs）是一类小分子化合物，它们通过一种通用的G-loop识别结构将目标蛋白招募至CRBN。研究人员利用结构化的G-loop模板进行的计算匹配算法预测了1600多种人类蛋白质，这些蛋白质具有表面暴露且与CRBN兼容的β-发夹或螺旋G-loop结构。基于表面的模拟搜索方法突破了G-loop模式，并为扩展CRBN靶标空间至G-loop降解之外提供了机会。
研究方法与结果
β-发夹G-loop靶标空间的探索与验证
通过计算方法挖掘人类蛋白质组中与CRBN兼容的β-发夹G-loop蛋白质。研究人员使用CK1α的β-发夹G-loop作为模板，从PDB和AlphaFold2模型中识别出6123个G-loop结构，分布在1424 个蛋白质中，这些结构不仅涵盖了已知的β-发夹G-loop靶标（例如IKZF1、IKZF2、GSPT1等），还包含大量C2H2锌指蛋白（C2H2 ZF）。除此之外，还有912个非C2H2类的β-发夹G-loop样结构，它们分布在729种蛋白质中，涉及96个不同的蛋白质类别和272种结构域类型。通过TurboID邻近标记实验和质谱分析验证了MGDs对预测靶标的招募能力，并使用TR-FRET和NanoBRET技术进一步验证了多个靶标的三元复合物形成，包括NEK7、MNAT1、PPIL4等，又通过突变实验确认了G-loop在CRBN结合中的关键作用。
新鉴定的非C2H2锌指蛋白类的β-发夹G-loop靶标
聚焦于验证非C2H2锌指蛋白类的β-发夹G-loop靶标。
研究人员选择了多个非C2H2锌指蛋白类的β-发夹G-loop靶标进行NanoBRET验证，包括PPIL4、MNAT1、WBP4、LIMD1、CHD7、ASS1、HNRNPD、RELB、GTF2B、MAD2L1和KIFC3等。通过实验验证了这些靶标的三元复合物形成，并通过突变实验确认了G-loop在CRBN结合中的关键作用。这些靶标覆盖了多种不同的蛋白质功能和结构域类型，进一步扩展了CRBN的靶标空间。
发现结构上不同的螺旋G-loop结构
探索CRBN是否能够通过螺旋G-loop结构识别靶标。
研究人员使用最小化的G-loop模板（5个残基）进行计算挖掘，识别出1633种蛋白质，其中包括184种携带螺旋G-loop的蛋白质。通过TR-FRET和NanoBRET技术验证了mTOR-FRB和多个酪氨酸激酶（如LCK、HCK、LYN）的三元复合物形成，并解析了mTOR-FRB与CRBN复合物的晶体结构。结果表明，螺旋G-loop通过其C端与CRBN的CULT结构域相互作用，形成与β-发夹G-loop相似的氢键，尽管在结构上有所不同，但都能被CRBN识别。
NEK7通过分化的PPI界面与CRBN结合
研究NEK7与CRBN的结合机制，并探索其降解机制。
研究人员通过化合物筛选发现化合物5能够诱导NEK7（即NIMA-related kinase 7，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在多种细胞过程中发挥关键作用）的降解，并且这种降解可以通过MLN-4924或lenalidomide竞争抑制。研究人员还解析了NEK7与CRBN复合物的晶体结构。结果表明，NEK7通过其β-发夹G-loop与CRBN结合，但结合方式与CK1α有所不同。NEK7的N端扩展区域对CRBN的结合至关重要，这种扩展界面在NEK7的降解中起关键作用。这些发现揭示了CRBN与不同靶标结合的多样性和灵活性。
VAV1通过分子表面模拟GSPT1 degron与CRBN结合
探索VAV1是否能够通过非G-loop依赖的方式与CRBN结合。
研究人员使用表面匹配算法，识别VAV1（即Vav鸟嘌呤核苷酸交换因子1，是一种重要的信号转导蛋白，在免疫细胞信号传导中具有关键作用）的SH3c结构域与GSPT1 degron之间的表面相似性，并通过TR-FRET和NanoBRET技术验证了VAV1与CRBN的结合。解析的晶体结构显示，VAV1的SH3c结构域通过其RT-loop与CRBN的关键残基形成氢键，模拟GSPT1 degron的结合方式，VAV1与CRBN的结合方式与GSPT1相似，但缺乏结构同源性。VAV1的RT-loop中的特定残基（如R798和S799）对CRBN的结合至关重要。这些结果表明，VAV1通过分子表面模拟与CRBN结合，进一步扩展了CRBN的靶标空间。
CRBN预测的PPI热点区域和已知新底物的足迹
展示CRBN表面的PPI热点区域，并映射已知新底物的结合足迹。
研究人员使用MaSIF程序计算CRBN表面的PPI倾向，并预测PPI热点区域。结果表明，CRBN表面的PPI热点区域具有高PPI倾向，这些区域与已知新底物的结合足迹高度重合。不同新底物通过不同的结合模式与CRBN的PPI热点区域相互作用，展示了CRBN的多功能性和靶标空间的多样性。
结语
回顾上文，我们已经了解到：除了已知的β-发夹G-loop外，还存在一种新的螺旋G-loop结构，这种结构也能被CRBN识别。这表明CRBN的靶标空间可以扩展到G-loop样基序之外。
VAV1蛋白的C末端SH3结构域（SH3c）虽然缺乏G-loop结构特征，但也能通过分子表面模拟机制与CRBN结合。这种结合依赖于VAV1 SH3c结构域的独特折叠，它通过形成与CRBN的关键氢键接触来模拟G-loop的相互作用。
CRBN具有极高的多功能性，能够通过不同的表面特征与多种靶标结合。这种多功能性为MGDs的开发提供了更广泛的靶标选择。
这项研究不仅扩展了CRBN的靶标空间，还重新定义了MGD诱导的新底物识别规则，为开发新一代MGDs提供了理论基础。通过计算和实验相结合的方法，研究人员能够系统地探索和验证CRBN的潜在靶标，为未来的小分子药物开发提供了新的靶点和机制。
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